A tecnologia patenteada NeoLUX é um teste de células vivas que mede o estado de homeostase ou dano celular por leitura de fluorescência. A tecnologia foi optimizada para um elevado rendimento em placas de 96 e 384 poços, adequadas para leitores de fluorescência comerciais, de acordo com um protocolo muito simples limitado à adição do marcador fluorescente no meio de cultura e a duas medições fluorescentes.

A tecnologia NeoLUX baseia-se na foto-indução de um biossensor que conduz a um sinal de fluorescência. Este aumento de fluorescência só é observado em células em homeostasia antes da adição do biossensor. O cálculo dos rácios de fluorescência antes e depois da aplicação do LED conduz a uma medição exacta e dependente da dose do estado de dano celular que se segue à toxicidade química ou física induzida pela amostra.

Princípio do método de teste NeoLux

O procedimento experimental é simples. O biossensor TO é adicionado ao meio de cultura celular e torna-se fluorescente após associação com os ácidos nucleicos das células. Quando o TO é fotoactivado por iluminação LED a 480 nm, o seu relaxamento é acompanhado por uma transferência de energia para a molécula intracelular de dioxigénio (3O2), resultando na produção de oxigénio singlete (1O2) e numa cascata de produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), incluindo o anião superóxido (O2.-) e o radical hidroxilo (OH.) (ver fig. 1). O efeito antioxidante de uma substância pode então ser medido pela sua capacidade de contrariar esta produção intracelular de ROS.

Curvas dose-efeito 

O efeito antioxidante intracelular é revelado por um atraso no aumento da fluorescência desencadeado pela foto-ativação do TO dependente do LED. A Figura 2 ilustra os perfis de fluorescência das células HepG2 humanas tratadas durante 4 horas com diferentes concentrações de resveratrol. O resveratrol é um poderoso antioxidante celular que é conhecido por ser ativo tanto como eliminador de ROS como indutor da defesa natural da célula conduzida pela via Nrf2. A curva de controlo (não tratada) está ilustrada a preto. As diferenças entre a área sob as curvas (AUC) do controlo e da amostra permitem estabelecer um índice que qualifica o efeito antioxidante intracelular da amostra.

EC50s e outros parâmetros que revelam efeitos antioxidantes

O cálculo do índice NeoLux a diferentes concentrações da amostra permite estabelecer perfis dose-efeito que se ajustam bem à regressão sigmoide, permitindo a avaliação da EC10 (Concentração de Eficácia 10%, limiar do efeito celular), da EC50 padrão (Concentração de Eficácia 50%) e da EC90 (Concentração de Eficácia 90%, dose mais fraca na qual o composto actua com um efeito máximo). A figura 3 ilustra um exemplo de curvas dose-efeito obtidas após tratamento com resveratrol durante 1 e 4 h em células HepG2 humanas.

NeoLux: um método de ensaio multifacetado

De um modo mais geral, os perfis de fluorescência NeoLux fornecem informações sobre vários parâmetros específicos da amostra testada e do modelo celular selecionado. Para além do efeito antioxidante acima descrito, o teste NeoLux evidencia os efeitos pró-oxidantes (desvio à esquerda do perfil da amostra) e os efeitos citotóxicos (fluorescência inicial elevada e iluminação não eficaz) (Figura 4), o que confere um valor acrescentado ao método. É também de salientar que a tecnologia NeoLux funciona em qualquer tipo de modelo celular eucariótico (animal, vegetal, fúngico) e procariótico (bactérias).

Características

• Para 1000 ou 4000 pontos de medição em placas de 96 poços
• Procedimento numa só etapa
• Sem lavagem
• Procedimento padrão para a maioria das linhas celulares (kit de otimização disponível, se necessário)
• Adaptado a linhas celulares, hiPSCs, células primárias,...
• 1 solução no kit (biossensor a ser diluído no meio de cultura)
• Armazenamento a 4°C
• Tempo até à expiração: 6 meses
• Também disponível para placas de 384 W.

Mecanismo

O processo é designado por sistema light-up cell porque o nível de fluorescência do biossensor fluorescente aumenta durante a sua fotoindução por iluminação. O biossensor entra passivamente nas células, mas é rapidamente removido das células funcionais por proteínas de transporte de efluxo, resultando num sinal fluorescente baixo. Quando a luz é aplicada, a fotoindução do biossensor gera ROS intracelulares, que alteram a homeostase celular ou a capacidade da célula para libertar o biossensor, desencadeando a sua entrada maciça no interior das células e resultando num aumento do sinal de fluorescência. Se as células tiverem sido previamente incubadas com uma substância tóxica, causando alteração do efluxo ou de outras funções celulares, o biossensor entra maciçamente, levando a um sinal de fluorescência elevado sem aumento após a aplicação da luz.

  Segurança

Este produto é apenas para fins de investigação e não para uso humano ou terapêutico. Potencialmente nocivo. Evitar a exposição prolongada ou repetida. Evitar o contacto com os olhos, a pele ou a roupa. Lavar abundantemente após manuseamento. Em caso de contacto com os olhos ou a pele, lavar as áreas afectadas com água abundante durante 15 minutos e consultar um médico. Em caso de inalação ou ingestão, levar a pessoa para uma zona ao ar livre e consultar imediatamente um médico.

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