NeoLux; Viability assessment by loss of efflux protein function

La tecnología patentada NeoLUX es una prueba de vida celular que mide el estado de homeostasis o daño celular mediante lectura de fluorescencia. La tecnología ha sido optimizada para un alto rendimiento en placas de 96 y 384 pocillos, apta para lectores de fluorescencia comerciales según un protocolo muy sencillo que se limita a la adición del marcador fluorescente en el medio de cultivo y a dos mediciones de fluorescencia.

La tecnología NeoLUX se basa en la fotoinducción de un biosensor que da lugar a una señal de fluorescencia. Este aumento de la fluorescencia sólo se observa en las células en homeostasis antes de la adición del biosensor. El cálculo de los ratios de fluorescencia antes y después de la aplicación del LED conduce a una medición precisa y dependiente de la dosis del estado de daño celular que sigue a la toxicidad química o física inducida por la muestra.

Principio del método de ensayo NeoLux

El procedimiento experimental es sencillo. El biosensor TO se añade al medio de cultivo celular y se vuelve fluorescente tras su asociación con los ácidos nucleicos celulares. Cuando el TO se fotoactiva mediante iluminación LED a 480 nm, su relajación va acompañada de una transferencia de energía a la molécula intracelular de dioxígeno (3O2) que da lugar a la producción de oxígeno singlete (1O2) y a una cascada de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que incluyen el anión superóxido (O2.-) y el radical hidroxilo (OH.) (ver fig. 1). El efecto antioxidante de una sustancia puede medirse entonces por su capacidad para contrarrestar esta producción intracelular de ROS.

Curvas dosis-efecto 

El efecto antioxidante intracelular se revela por un retardo temporal en el aumento de fluorescencia desencadenado por la fotoactivación de TO dependiente de LED. La figura 2 ilustra los perfiles de fluorescencia de células humanas HepG2 tratadas 4 h a diferentes concentraciones de resveratrol. El resveratrol es un potente antioxidante celular conocido por su actividad como eliminador de ROS y como inductor de las defensas naturales celulares a través de la vía Nrf2. La curva de control (no tratada) se ilustra en negro. Las diferencias entre el área bajo la curva (AUC) del control y de la muestra permiten establecer un índice que califica el efecto antioxidante intracelular de la muestra.

EC50 y otros parámetros que revelan los efectos antioxidantes

El cálculo del índice NeoLux a diferentes concentraciones de la muestra permite establecer perfiles dosis-efecto que se ajustan bien a la regresión sigmoidea, permitiendo la evaluación de la EC10 (Concentración de Eficacia 10%, umbral del efecto celular), la EC50 estándar (Concentración de Eficacia 50%) y la EC90 (Concentración de Eficacia 90%, dosis más débil a la que el compuesto actúa con un efecto máximo). La figura 3 ilustra un ejemplo de curvas dosis-efecto obtenidas tras el tratamiento con resveratrol durante 1 y 4 h en células humanas HepG2.

NeoLux : un método de ensayo polifacético

De forma más general, los perfiles de fluorescencia NeoLux proporcionan información sobre varios parámetros específicos de la muestra analizada y del modelo celular elegido. Además del efecto antioxidante descrito anteriormente, el ensayo NeoLux pone de manifiesto los efectos prooxidantes (desplazamiento hacia la izquierda del perfil de la muestra) y los efectos citotóxicos (la fluorescencia inicial es elevada y la iluminación sigue siendo ineficaz) (Figura 4), lo que aporta un valor añadido al método. También cabe destacar que la tecnología NeoLux funciona en cualquier tipo de modelo celular eucariota (animal, vegetal, fúngico) y procariota (bacteria).

Características

• Para 1000 o 4000 puntos de medida en placas de 96 pocillos
• Procedimiento en un solo paso
• Sin lavado
• Procedimiento estándar para la mayoría de las líneas celulares (kit de optimización disponible si es necesario)
• Adaptado a líneas celulares, hiPSCs, células primarias,...
• 1 solución en el kit ( biosensor a diluir en el medio de cultivo)
• Almacenamiento 4°C
• Tiempo de caducidad 6 meses
• También disponible para placas 384-w

Mecanismo

El proceso se denomina light-up cell system porque el nivel de fluorescencia del biosensor fluorescente aumenta durante su fotoinducción por iluminación. El biosensor entra pasivamente en las células, pero es eliminado rápidamente de las células funcionales por proteínas transportadoras de eflujo, lo que da lugar a una señal fluorescente baja. Cuando se aplica la luz, la fotoinducción del biosensor genera ROS intracelulares, que alteran la homeostasis celular o la capacidad de la célula para liberar el biosensor, desencadenando su entrada masiva en el interior de las células y dando lugar a un aumento de la señal de fluorescencia. Si las células han sido previamente incubadas con una sustancia tóxica, causando la alteración del eflujo u otras funciones celulares, el biosensor entra masivamente, dando lugar a una alta señal de fluorescencia sin aumento tras la aplicación de luz.

 Seguridad

Este producto es sólo para fines de investigación y no para uso humano o terapéutico. Potencialmente nocivo. Evitar la exposición prolongada o repetida. Evítese el contacto con los ojos, la piel o la ropa. Lávese a fondo después de manipularlo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lavar las zonas afectadas con abundante agua durante 15 minutos y acudir al médico. En caso de inhalación o ingestión, trasládese al aire libre y acúdase inmediatamente al médico.

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