Protocolo de inmunohistoquímica - Método de la avidina/biotina (ABC)
El principio de los kits de detección ABC se basa en la afinidad de la avidina (o estreptavidina) por la biotina. De hecho, la abreviatura ABC significa Complejo Avidina / Biotina.
En general, los kits de detección ABC se componen de:
- Un anticuerpo secundario biotinilado
I. Material necesario
Reactivos
- Un anticuerpo primario , marcado o no, contra la molécula diana
- Kit revelación
- Cromógeno
Búferes
- Xileno
- Baños alcohólicos al 70%, 80%y 95%
- Peróxido de hidrógeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
Reactivos
- Un anticuerpo primario , marcado o no, contra la molécula diana
- Kit revelación
- Cromógeno
Búferes
- Xileno
- Baños alcohólicos al 70%, 80%y 95%
- Peróxido de hidrógeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
II. Tiempo de experimentación
- 10 minpara el bloqueo de la peroxidasa
- 30 min para la recuperación de antígenos (si es necesario)
- 30-60 minpara incubación con anticuerpo primario
- 10 minpara inubación con anticuerpo secundario biotinilado
- 10 minpara incubación con conjugado de estreptvidina peroxidasa
- 5 minpara cromógeno
- 5 minpara cromógeno
- Tinción con hematoxilina (opcional)
- TOTAL : 2-3 horas
- TOTAL : 2-3 horas
III. Protocolo
- Bloqueo de peroxidasa : Aplicar 2 gotas (100 µl) o volumen suficiente de reactivo de bloqueo de peroxidasa (solución al 3%H2O2) para cubrir la sección de tejido e incubar. Enjuagar el portaobjetos con agua destilada
- Pretratamiento HIER (consulte la hoja de especificaciones del anticuerpo) : La Recuperación de Epítopos Inducida por Calor (HIER) puede ser necesaria para el anticuerpo primario sugerido por el proveedor. Lavar con PBS 2 min, 3 veces.
- Pre-bloqueo : Añadir 2 gotas o un volumen suficiente de solución de pre-bloqueo para cubrir completamente la sección de tejido e incubar. Secar la solución, no enjuagar.
- Anticuerpo primario (suministrado por el usuario) : Aplicar 2 gotas o un volumen suficiente de anticuerpo primario para cubrir completamente la sección de tejido. Incubar en cámara húmeda durante 30-60 min.
- Anticuerpo secundario : Aplicar 2 gotas o volumen suficiente de anticuerpo primario para cubrir completamente la sección de tejido. Incubar durante 10 min.
- HRP-estreptavidina : Aplicar 2 gotas o volumen suficiente de HRP-estreptavidina para cubrir completamente la sección de tejido e incubar 10 min. Aclarar con PBS durante 2 min, 3 veces.
-- Cromógeno : Añadir 1 gota o 2 gotas (para mayor sensibilidad y contraste) de concentrado de cromógeno a 1 ml de Substrat. Mezclar bien, proteger de la luz y utilizar antes de 5 horas. Aplicar 2 gotas (100 µl) o volumen suficiente de cromógeno premezclado para cubrir completamente el tejido e incubar 5 minutos. Aclarar con agua destilada durante 2 min, 3 veces.
- Hematoxilina (opcional) : Tinción con 2 gotas (100 µl) o más gotas para cubrir completamente el tejido y esperar unos 10-20 seg. Aclarar bien con agua del grifo durante 1-2 min. Poner los portaobjetos en PBS hasta que muestren color azul (unos 30-60 seg). Aclarar bien con agua destilada.
- Montaje : Siga las instrucciones de montaje de la ficha técnica del fabricante.
Notas :
- La fijación, el grosor del portaobjetos, la recuperación del antígeno, la dilución primaria y el tiempo de incubación afectan significativamente a los resultados. El investigador debe tener en cuenta todos los factores y determinar las condiciones óptimas para interpretar los resultados.
- La tinción de tejidos depende de la manipulación y el procesamiento adecuados de los tejidos antes de la tinción. Una preparación inadecuada de los tejidos puede dar lugar a resultados falsos negativos o a resultados inconsistentes.
- No mezclar reactivos de diferentes lotes.
- No deje que los portaobjetos se sequen en ningún momento durante la tinción.