Protocolo experimental para Western Blotting
Western blot es una técnica utilizada para identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas. Antes del Western blot, las muestras se someten a un paso de separación de proteínas por tamaño mediante electroforesis en gel. El Western blot incluye la transferencia de las proteínas separadas por tamaño a un soporte sólido y la detección de proteínas específicas dentro de la muestra. Los Western blots son altamente sensibles y específicos; el proceso incorpora un sistema de detección de anticuerpos altamente selectivo para identificar las proteínas diana dentro de una muestra, lo que permite al investigador detectar con precisión las proteínas en función de los pesos moleculares.
Los pasos individuales del procedimiento son modificables y factores como la concentración del gel, la duración de la incubación y el voltaje utilizado en el tiempo de ejecución pueden optimizarse en función de las necesidades. Estos atributos hacen de Western blot un método altamente preciso, flexible y semicuantitativo para la identificación de proteínas.
Separación de proteínas por electroforesis en gel
Antes de proceder al Western blot, las proteínas de una muestra deben separarse en función de su tamaño. Normalmente, esto se hace mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), en la que la concentración de poliacrilamida junto con el sistema tampón influye en la movilidad de las proteínas a través del gel en función de su peso molecular. El gel en SDS-PAGE tiene dos capas distintas, denominadas gel de «apilamiento» (capa superior) y gel de «separación» o «resolución» (capa inferior).
Como se muestra en la tabla siguiente, la concentración del gel de resolución debe corresponder al tamaño de la proteína objetivo.
| Tamaño de la proteína (kDa) | Concentración de poliacrilamida |
| ≥500 | 5% |
| 25-200 | 8% |
| 15-100 | 10% |
| 10-70 | 12.5% |
| 12-45 | 15% |
| 4-40 | 20% |
Los geles SDS-PAGE pueden comprarse o fabricarse fácilmente en casa. Una receta común para hacer un gel SDS-PAGE es la siguiente. Si utiliza un gel prefabricado, pase a la sección siguiente.
| Reactivos | 6% Gel de apilamiento | 10% Gel de separación |
| ddH2O | 2 mL | 3 mL |
| 1 M Tris-HCl | 400 uL pH 6.7 | 2.1 mL pH 8.9 |
| 30% Acrylamide/Bis- Acrylamide | 600 uL | 2.8 mL |
| 10% SDS | 36 uL | 80 uL |
| 10% APS (Persulfato de amonio) | 24 uL | 50 uL |
| TEMED (TetraMethylEthyleneDiamine) | 4 uL | 6 uL |
- Monte el kit de colado en gel siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto incluye la inserción de las placas de vidrio en el marco de colado y su bloqueo en su lugar.
- Inserte el marco de colado en el soporte de colado. Coloque el peine adecuadamente.
- Con un rotulador, marque el vidrio ~ 1 cm por debajo del peine. Esto indica el nivel de gel separador necesario.
- Retire el peine. Con una pipeta, añada una pequeña cantidad de agua en la cámara de gel para asegurarse de que no hay fugas. Elimine el agua con una toallita KimWipe.
- Mezclar todos los ingredientes del gel de separación, asegurándose de añadir TEMED en último lugar.
- Pipetear el gel separador en la cámara, hasta su marcador.
- Para eliminar las burbujas, pipetee suavemente una pequeña cantidad de alcohol isopropílico (IPS) en la parte superior del gel. Deje que el gel se endurezca durante 30 minutos.
- Retire el IPA introduciendo suavemente una toallita KimWipe en la cámara.
- Mezclar todos los ingredientes del gel de apilamiento, asegurándose de añadir TEMED en último lugar.
- Pipetear el gel de apilamiento en la cámara, hasta la parte superior de la placa de vidrio.
- Introduzca el peine. Deje que el gel se endurezca durante otros 30 minutos.
Preparación de la muestra
Las proteínas suelen extraerse de células o tejidos utilizando diversos tampones de extracción que contienen detergentes, sales e inhibidores de proteasas para mantener la integridad y estabilidad de las proteínas.
La cantidad de proteína presente en la muestra se estima por los métodos siguientes:
- Método directo basado en la absorción a 280 nm por espectroscopia UV.
- Ensayo de proteínas de Bradford (calculadora de ensayos de Bradford).
- Ensayo de cuantificación de proteínas BCA (kits de ensayo Amplite® Colorimetric o Amplite® Fluorimetric o Portelite™ Fluorimetric).
Para desnaturalizar las proteínas e interrumpir cualquier interacción no covalente, se añade al tampón de muestra un agente reductor como el β-mercaptoetanol o el ditiotreitol (DTT). Además, calentar las muestras a unos 95 °C durante 5 minutos o a 70 °C durante 10 minutos ayuda a desnaturalizar completamente las proteínas. Se añade un colorante de carga a las muestras de proteínas para aumentar su densidad, proporcionar color para su visualización y seguir la migración de las muestras durante la electroforesis. El colorante suele contener un colorante de rastreo (por ejemplo, azul de bromofenol o xilenocianol) y un agente denso (por ejemplo, glicerol) para ayudar a que las muestras se hundan en los pocillos.
Electroforesis en gel
Equipo necesario :
- Cámara de electroforesis y fuentes de alimentación
- Micropipeta
Reactivos necesarios :
- Gel SDS-PAGE
- Tampón de ejecución 1X (Receta para tampón de ejecución 10X)
- Muestras de proteínas
- Escala de proteínas (PageTell™ Prestained 10-250 kDa Ladder o ProLite™ 5-245 kD Protein Ladder)
- Introduzca el casete de gel en la cámara de electrodos. Coloque la cámara de electrodos en la cubeta de electroforesis.
- Retirar el peine del gel.
- Añadir ~200 mL de tampón 1x a la cámara interior del electrodo.
- Llenar la cámara exterior del tanque hasta la marca indicadora presente en el exterior del tanque. Asegurarse de que el tampón cubra completamente el gel.
- Calentar las muestras en un baño de agua a 95°C durante 5 min o a 70°C durante 10 min.
- Añada las muestras y los ladders de proteínas a los pocillos identificados. El volumen depende de la muestra, pero generalmente es entre 5 - 15 uL por pocillo. El volumen en cada carril debe igualarse utilizando ddH20 o tampón de lisis.
- Conecte el tanque de electroforesis a su fuente de alimentación, rojo (+) a rojo, negro (-) a negro.
- Ejecute su gel para el voltaje deseado y durante el tiempo deseado. Generalmente, estos parámetros son 100 - 150 V durante 40 a 60 minutos.
La proteína separada en el gel puede teñirse con ProLite™ Orange Protein Gel Stain para visualizar la proteína total presente en el gel.
Electrotransferencia
A continuación, las proteínas separadas presentes en el gel se transfieren a una membrana mediante un proceso denominado electrotransferencia (también electroblotting).
Equipo necesario :
- Aparato de transferencia
- Esponja o espuma, cortada de la misma dimensión que el gel
- 6 papeles de filtro, cortados de la misma dimensión que el gel
- Bandeja de montaje o casete de secado
Reactivos necesarios :
- Hielo
- Metanol
- Membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) o de nitrocelulosa, cortada con las mismas dimensiones del gel
- Tampón de transferencia 1X (Receta para tampón de transferencia 20X)
- Humedecer la esponja, los papeles de filtro y la membrana con metanol.
- Extraiga con cuidado el gel del casete de gel.
- Montar cuidadosamente un sándwich de electrotransferencia apilándolo en el siguiente orden :
-
(a) Montaje fondo bandeja
-
(b) Esponja de presión
-
(c) Papeles de filtro
-
(d) Gel
-
(e) Membrana de PVDF
-
(f) Papeles de filtro
-
(g) Montaje bandeja superior
-
- Asegúrese de que no queden burbujas de aire en el sándwich. Exprima suavemente el líquido sobrante.
- Colocar el sándwich en la cubeta de electroblotting, sobre hielo.
- Añadir tampón de transferencia a la cubeta de electroblotting, cubriendo completamente el sándwich.
- Conecte la cubeta de electroblotting a su fuente de alimentación, rojo (+) a rojo, negro (-) a negro.
- Haga funcionar el sistema de electroblotting durante el tiempo deseado, que oscila entre 45 y 90 minutos.
Bloqueo
Un paso de bloqueo evitará que los anticuerpos se unan inespecíficamente a la membrana. El bloqueo elimina el posible ruido de fondo de la membrana, lo que simplifica el análisis de proteínas. Los bloqueantes utilizados habitualmente son BSA al 2-5% o leche en polvo desgrasada en solución salina tamponada (TBS o PBS).
Tabla 1. Comparación de tampones de bloqueo para western blotting.
| Búfer de bloqueo | Beneficios | Consideraciones |
| Leche desnatada |
|
Contiene biotina y fosfoproteínas, que pueden interferir con las estrategias de detección de estreptavidina-biotina y la detección de proteínas diana fosforiladas. Debido al número de proteínas que contiene la leche, ésta puede enmascarar algunos antígenos y disminuir el límite de detección del western blot. |
| Proteínas purificadas |
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Más caro que las fórmulas tradicionales de leche descremada. |
| Albúmina sérica bovina (BSA) |
|
Existen en el mercado diversos grados de BSA que pueden afectar a la relación señal-ruido. La BSA es generalmente un parpadeo más débil, lo que puede dar lugar a una unión de anticuerpos más inespecífica, pero puede aumentar la sensibilidad de detección de proteínas poco abundantes. |
Incubación de anticuerpos primarios y secundarios
La proteína de interés en un Western blot puede detectarse utilizando un anticuerpo primario marcado o un anticuerpo primario no marcado + un anticuerpo secundario marcado.
- Añadir el anticuerpo primario en 5% de BSA (albúmina de suero bovino) a la membrana.
- Incubar la membrana toda la noche a 4°C en un agitador o durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Si se utiliza un anticuerpo secundario, lavar la membrana tres veces con TBST. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana tres veces con TBST.
Detección
En Western blotting, se utilizan métodos de detección para visualizar y cuantificar la presencia de proteínas específicas que se han transferido del gel a la membrana. Pueden emplearse varios métodos de detección, dependiendo de los requisitos específicos del experimento y del tipo de etiqueta presente en su anticuerpo de detección.
A continuación se presentan algunos métodos de detección utilizados habitualmente en Western blotting:
Quimioluminiscencia
Los sustratos quimioluminiscentes como el Amplite® West ECL HRP Substrate generan luz tras la reacción enzimática con la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP), que se conjugan con anticuerpos secundarios. Es un método sensible y proporciona una señal duradera.
Fluorescencia
Los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia se unen directamente a los anticuerpos primarios, o bien los anticuerpos primarios se detectan utilizando anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. Este método permite la multiplexación, una alta sensibilidad y la compatibilidad con diversos sistemas de obtención de imágenes.
La Guía de Selección de Anticuerpos y Etiquetado de Proteínas puede ser útil en la planificación de Western blotting y otros inmunoensayos al proporcionar información sobre la elección de los anticuerpos más adecuados para necesidades experimentales específicas.
Detección colorimétrica
Los sustratos enzimáticos producen un producto de reacción coloreado al reaccionar con HRP o AP conjugados con anticuerpos secundarios que pueden utilizarse para visualizar proteínas en western blot.
Análisis
En el análisis Western blot, las imágenes claras de blot se obtienen mediante equipos especializados. La intensidad de las bandas puede cuantificarse con programas informáticos de análisis de imágenes, a menudo normalizándolas con controles internos para obtener comparaciones precisas. Las pruebas estadísticas evalúan las diferencias entre las muestras analizadas, lo que ayuda a extraer conclusiones significativas.
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