Protocolo experimental para Western Blotting

O Western blot é uma técnica utilizada para identificar proteínas específicas a partir de uma mistura complexa de proteínas. Antes do Western blot, as amostras são submetidas a uma fase de separação de proteínas por tamanho através de eletroforese em gel. O Western blot inclui a transferência de proteínas separadas por tamanho para um suporte sólido e a deteção de proteínas específicas na amostra. Os Western blots são altamente sensíveis e específicos; o processo incorpora um sistema de deteção de anticorpos altamente seletivo para identificar as proteínas alvo numa amostra, o que permite ao investigador detetar com precisão as proteínas com base nos pesos moleculares.

Os passos individuais do procedimento são modificáveis e factores como a concentração do gel, a duração da incubação e a voltagem utilizada no tempo de execução podem ser optimizados em função das necessidades. Estes atributos fazem do Western blot um método altamente preciso, flexível e semi-quantitativo para a identificação de proteínas.

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Separação de proteínas por eletroforese em gel

Antes do Western blot, as proteínas de uma amostra devem ser separadas com base no seu tamanho. Normalmente, isto é feito utilizando SDS-PAGE (Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio), em que a concentração de poliacrilamida, juntamente com o sistema tampão, influencia a mobilidade das proteínas através do gel, dependendo do seu peso molecular. O gel na SDS-PAGE tem duas camadas distintas, designadas por gel de “empilhamento” (camada superior) e gel de “separação” ou “resolução” (camada inferior).

Como indicado na tabela abaixo, a concentração do gel de resolução deve corresponder ao tamanho da sua proteína alvo.

Tamanho da proteína (kDa)	Concentração de poliacrilamida
≥500	5%
25-200	8%
15-100	10%
10-70	12.5%
12-45	15%
4-40	20%

Os géis SDS-PAGE podem ser comprados ou facilmente fabricados em casa. Uma receita comum para fazer um gel SDS-PAGE é a seguinte. Se utilizar um gel pré-fabricado, passe à secção seguinte.

Reagentes	6% Gel de empilhamento	10% Gel de separação
ddH2O	2 mL	3 mL
1 M Tris-HCl	400 uL pH 6.7	2.1 mL pH 8.9
30% Acrilamida/Bis-acrilamida	600 uL	2.8 mL
10% SDS	36 uL	80 uL
10% APS (Persulfato de amónio)	24 uL	50 uL
TEMED (TetraMethylEthyleneDiamine)	4 uL	6 uL

Montar o kit de moldagem em gel de acordo com as instruções do fabricante. Isto inclui a inserção das placas de vidro na estrutura de fundição e o seu bloqueio no lugar.
Inserir a estrutura de fundição no suporte de fundição. Colocar o pente corretamente.
Utilizando um marcador, marcar o vidro ~ 1 cm abaixo do pente. Isto indica o nível de gel de separação necessário.
Retirar o pente. Utilizando uma pipeta, adicionar uma pequena quantidade de água à câmara do gel para garantir que não existem fugas. Retirar a água com um KimWipe.
Misture todos os ingredientes do gel separador, certificando-se de que adiciona o TEMED em último lugar.
Pipete o gel separador para a câmara, até ao seu marcador.
Para remover as bolhas, pipete suavemente uma pequena quantidade de álcool isopropílico (IPS) para o topo do gel. Deixar o gel assentar durante 30 minutos.
Remova o IPA inserindo suavemente um KimWipe na câmara.
Misture todos os ingredientes do gel de empilhamento, certificando-se de que adiciona o TEMED em último lugar.
Pipete o gel de empilhamento para dentro da câmara, até ao topo da placa de vidro.
Introduzir o pente. Deixe o gel assentar durante mais 30 minutos.

Preparação da amostra

As proteínas são normalmente extraídas de células ou tecidos utilizando vários tampões de extração que contêm detergentes, sais e inibidores de proteases para manter a integridade e estabilidade das proteínas.

A quantidade de proteínas presentes na amostra é estimada pelos seguintes métodos:

Método direto baseado na absorção a 280nm por espetroscopia UV.
Ensaio de Proteína de Bradford (Calculadora de Ensaio de Bradford)
Ensaio de quantificação de proteínas BCA (kits de ensaio Amplite® Colorimétrico ou Amplite® Fluorimétrico ou Portelite™ Fluorimétrico).

Para desnaturar as proteínas e perturbar quaisquer interacções não covalentes, é adicionado ao tampão de amostra um agente redutor como o β-mercaptoetanol ou o ditiotreitol (DTT). Além disso, o aquecimento das amostras a cerca de 95°C durante 5 minutos ou a 70°C durante 10 minutos ajuda a desnaturar completamente as proteínas. Adiciona-se um corante de carga às amostras de proteínas para aumentar a sua densidade, dar cor para visualização e seguir a migração das amostras durante a eletroforese. O corante contém normalmente um corante de rastreio (por exemplo, azul de bromofenol ou xileno cianol) e um agente denso (por exemplo, glicerol) para ajudar as amostras a afundarem-se nos poços.

Eletroforese em gel

Equipamento necessário :

Câmara de eletroforese e fontes de alimentação
Micropipeta

Reagentes necessários :

Gel SDS-PAGE
Tampão de corrida 1X (Receita para tampão de corrida 10X)
Amostras de proteínas
Escada de proteínas (escada PageTell™ 10-250 kDa pré-colorada ou escada de proteínas ProLite™ 5-245 kD)

Introduzir a cassete de gel na câmara de eléctrodos. Colocar a câmara de eléctrodos na cuba de eletroforese.
Retirar o pente do gel.
Adicionar ~200 mL de tampão de corrida 1x à câmara interna do elétrodo.
Encher a câmara exterior da cuba até à marca indicadora presente no exterior da cuba. Certificar-se de que o tampão de corrida cobre completamente o gel.
Aquecer as amostras num banho de água a 95°C durante 5 min ou a 70°C durante 10 min.
Adicionar as amostras e as proteínas ladders aos poços identificados. O volume depende da amostra, mas geralmente é de 5 a 15 uL por poço. O volume em cada pista deve ser igual, utilizando ddH20 ou tampão de lise.
Ligar a cuba de eletroforese à fonte de alimentação, vermelho (+) a vermelho, preto (-) a preto.
Fazer correr o gel com a voltagem e o tempo desejados. Geralmente, estes parâmetros são 100 - 150 V durante 40 a 60 minutos.

A proteína separada no gel pode ser corada com ProLite™ Orange Protein Gel Stain para visualizar a proteína total presente no gel.

Electrotransferência

Em seguida, as proteínas separadas presentes no gel são transferidas para uma membrana através de um processo designado por electrotransferência (também designado por electroblotting).

Equipamento necessário :

Aparelho de transferência
Esponja ou espuma, cortada com a mesma dimensão do gel
6 papéis de filtro, cortados com a mesma dimensão do gel
Bandeja de montagem ou cassete de blotting

Reagentes necessários :

Gelo
Metanol
Membrana de PVDF (fluoreto de polivinilideno) ou de nitrocelulose, cortada com as mesmas dimensões do gel
Tampão de transferência 1X (receita para o tampão de transferência 20X)

Humedecer a esponja, os papéis de filtro e a membrana com metanol.
Retirar cuidadosamente o gel da cassete de gel.
Montar cuidadosamente uma sanduíche de electrotransferência, empilhando-a pela seguinte ordem
- (a) Fundo do tabuleiro de montagem
- (b) esponja de ressecagem
- (c) Papéis de filtro
- (d) Gel
- (e) Membrana PVDF
- (f) Papéis de filtro
- (g) Montagem do tabuleiro superior
Certifique-se de que não existem bolhas de ar na sanduíche. Espremer suavemente o líquido extra.
Colocar a sanduíche na cuba de electroblotting, com gelo.
Adicionar tampão de transferência à cuba de electroblotting, cobrindo completamente a sanduíche.
Ligue a cuba de electroblotting à sua fonte de alimentação, vermelho (+) a vermelho, preto (-) a preto.
Colocar o sistema de electroblotting em funcionamento durante o tempo desejado, que varia entre 45 e 90 minutos.

Bloqueio

Um passo de bloqueio impedirá que os anticorpos se liguem de forma não específica à membrana. O bloqueio elimina o potencial ruído de fundo da membrana, simplificando a análise das proteínas. Os bloqueadores habitualmente utilizados são 2-5% de BSA ou leite seco não gordo em solução salina tamponada (TBS ou PBS).

Tabela 1. Comparação de tampões de bloqueio para western blotting.

Tampão de bloqueio	Benefícios	Considerações
Leite magro	Barato Contém vários tipos de proteínas	Contém biotina e fosfoproteínas, que podem interferir com estratégias de deteção de estreptavidina-biotina e deteção de proteínas alvo fosforiladas. Devido ao número de proteínas presentes no leite, este pode mascarar alguns antigénios e diminuir o limite de deteção do western blot.
Proteínas purificadas	Os tampões de bloqueio de proteína única podem proporcionar menos hipóteses de reação cruzada com os componentes do ensaio do que as soluções de soro ou leite. Ideal quando os bloqueadores, como o leite magro, bloqueiam a ligação antigénio-anticorpo	Mais caro do que as formulações tradicionais de leite não gordo.
Albumina de soro bovino (BSA)	Single-protein blocking buffers may offer less chance of cross-reacting with assay components than whey or milk solutions.Ideal when blockers, such as low-fat milk, block antigen-antibody binding	Estão disponíveis comercialmente vários graus de BSA que podem afetar a relação sinal-ruído. A BSA é geralmente um sinal mais fraco, o que pode resultar numa ligação não específica do anticorpo, mas pode aumentar a sensibilidade de deteção para proteínas pouco abundantes.

Incubação de anticorpos primários e secundários

A proteína de interesse num Western blot pode ser detectada utilizando um anticorpo primário marcado ou um anticorpo primário não marcado + anticorpo secundário marcado.

Adicionar o anticorpo primário em 5% de BSA (albumina de soro bovino) à membrana.
Incubar a membrana durante a noite a 4°C num agitador ou durante 1 hora à temperatura ambiente.
Se utilizar um anticorpo secundário, lavar a membrana três vezes com TBST. Incubar a membrana com o anticorpo secundário durante 1 hora à temperatura ambiente.
Lavar a membrana três vezes com TBST.

Deteção

No Western blotting, os métodos de deteção são utilizados para visualizar e quantificar a presença de proteínas específicas que foram transferidas do gel para a membrana. Podem ser utilizados vários métodos de deteção, dependendo dos requisitos específicos da experiência e do tipo de marcador presente no anticorpo de deteção.

Seguem-se alguns métodos de deteção habitualmente utilizados em Western blotting:

Quimiluminescência

Os substratos quimioluminescentes, como o substrato Amplite® West ECL HRP, geram luz após reação enzimática com peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP), que estão conjugadas com anticorpos secundários. É um método sensível e produz um sinal de longa duração.

Fluorescência

Os anticorpos secundários marcados com fluorescência ligam-se diretamente aos anticorpos primários, ou os anticorpos primários são detectados utilizando anticorpos secundários conjugados com fluoróforos. Esta abordagem permite capacidades de multiplexagem, elevada sensibilidade e compatibilidade com vários sistemas de imagiologia.

O Guia de Seleção de Anticorpos e Etiquetagem de Proteínas pode ser útil no planeamento de Western blotting e outros imunoensaios, fornecendo informações sobre a escolha dos anticorpos mais adequados para necessidades experimentais específicas.

Deteção colorimétrica

Os substratos enzimáticos produzem um produto de reação colorido após reação com HRP ou AP conjugado com anticorpos secundários que podem ser utilizados para visualizar proteínas em western blot.

Análise

Na análise Western blot, as imagens claras da mancha são visualizadas utilizando equipamento especializado. A intensidade das bandas pode ser quantificada com software de análise de imagem, normalizando frequentemente para controlos internos para comparações precisas. Os testes estatísticos avaliam as diferenças entre as amostras analisadas, ajudando a tirar conclusões significativas.

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